一.需要而未提供的試劑和器材
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水

二.試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

三.操作步驟
1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.  設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

四.實驗結(jié)果計算
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

五.試劑盒性能
1. 檢測范圍：20 μg/mL – 640 μg/mL。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 μg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。

六.注意事項
1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9.不能使用過期產(chǎn)品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。